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ASPETTI PRATICI TEORICI E NORMATIVI
Aspetti Pratici , teorici e normativi
CDER : center for drug evaluation and research Drug Administration
FDA : Food and Drug administration
GEL – CLOT
IL Limulus Amebocite Lysate ( LAL ) , se impiegato seguendo le linee guida della Food and Drug Administration USA , può sostituire il test del Coniglio per Pirogeni
riportato nella Pharmacopea USA ( ” GUIDELINE ON VALIDATION OF THE LIMULUS AMEBOCITE LYSATE TEST ” ) Dicembre 1987
MVD = Limite x Potency / lambda
mvc = Potency / MVD
Alert Limit ( AL )
Per poter testare il prodotto con un margine di sicurezza ( AL ) pari ad un fattore 2 , per calcolare la TD ( test dilution = diluzione di lavoro ) che viene considerata la metà
del Limite endotossinico calcolato , cioè :
AL = EL / 2 test Gel Clot
AL = EL / 10 test Turbidimetrico
EL = Limite Endotossinico
L’ uso di Materiali in Plastica
Il certificato di Apirogenicità per i materiali in plastica non è una garanzia di Idoneità .
E’ consigliabile , verificare il livello di Apirogenicità ( LABEL – CLAIM ) , per assicurarsi dell’essenza di Inibizione o stimolazione
Il sangue blu dei granchi reali
Da circa 40 anni la sicurezza di buona parte delle cose che vengono iniettate nel nostro sangue è garantita da un particolare animale, e dai salassi a cui l'uomo lo sottopone
Validation LAL Test-Depirogenizzazione
VALIDAZIONE
– Istruzioni del produttore dei reattivi
– SOPs riferite a :
USP-BET
FDA LAL Test Guideline
GMP , 21 CFR 211
Biologics , 21 CFR 610
Si devono includere : dati di valutazione
a) Validazione LAL
b) Validazione del personale
c) Validazione del prodotto
— Standardizzazione RSE/CSE
VALIDAZIONE
La validazione è la prova sicura e documentata che un determinato processo produrra’ in modo continuo e con la qualità specificata , i risultati attesi .
Questo significa che si deve essere in grado di dimostrare e documentare che il sistema , o metodo farà nelle nostre mani cio’ che il produttore afferma .
Quando validare il Lisato ( validazione LAL)
– Ogni qual volta viene cambiato lotto del LAL o della CSE
– Ogni qual volta vengono apportate delle modifiche alle condizioni del Test
– Nel momento dell’introduzione del LAL-Test in un laboratorio
Devono essere preparate , a partire da una soluzione madre di RSE una serie di diluizioni le cui concentrazioni sono :
-2 Lambda , lambda , 1/2 Lambda , 1/4 Lambda
Devono essere eseguite 4 repliche per ciascun livello di diluizione ed alle prove devono essere aggiunti due contrlli negativi ( acqua per LAL )
Se la sensibilità trovata risulta essere compresa entro 2 Lambda e 1/2 Lambda della sensibilità ( Lambda ) dichiarata , la sensibilità è CONFERMATA e viene considerata sempre la sensibilita’ trovata e non quella dichiarata dal fornitore .
Validazione del personale di laboratorio
Allo scopo di escludere l’interferenza di eventuali fattori esterni di variabilità , legati alla manualità dell’operatore e all’idoneità del materiale usato , ciascun analista addetto all’esecuzione del LAL-Test deve ricostituire una soluzione di lisato secondo le indicazioni del fornitore e una soluzione madre di CSE ( caratterizzata in precedenza con RSE ) in acqua per LAL .
Dalla soluzione madre di CSE devono essere preparate una serie di diluizioni scalari con un fattore di diluizione 1:2 in modo tale che una delle concentrazioni di endotossina sia corrispondente al valore di sensibilità del lisato( Lambda ) e che una delle ultime diluizioni reagendo con il lisato , dia sicuramente esito negativo ( – ).
CSE in acqua per LAL
REPLICHE 2 lambda 1 lambda 0,5 lambda 0,25 lambda CN *
1 + + – – –
2 + + – – –
3 + + – – n.e.
4 + + – – n.e.
LAL Gel Clot Risultati , conferma della sensibilità del lisato
Sensibilità del lisato dichiarata dal fornitore = 0,125 EU/ml
Range di accettabilità da 0,25 EU/ml a 0,06 EU/ml
Media geometrica = Antilogaritmo di 4 X Log ( 0,125 ) / 4 = 0,125 EU/ml
* Acqua per LAL
n.e. = non eseguito
La sensibilità del Lisato è confermata !
I valori di concentrazione cirrispondenti alle ultime quattro risposte positive vengono convertiti in Log e D.S. dei valori ottenuti deve risultare non superiore a 0,365.
In caso contrario , il saggio deve essere ripetuto con otto repliche per ciascun livello di diluizione e la nuova D.S. , basata sulle ultime otto risposte positive , deve risultare non superiore a 0,306 ; Cmq in entrambi i casi la sensibilità calcolata deve essere compresa tra 2 lambda e 0,5 lambda .
Convalida di un prodotto
Allo scopo di individuare la concentrazione di un prodotto non interferente , deve essere allestita una prova di confronto facendo reagire la CSE con il lisato in presenza e in assenza del prodotto da esaminare .
La concentrazione sarà quella che risulta non interferente nelle prove preliminari ( vedi prove preliminari )
Devono essere pertanto preparate a partire da una soluzione madre di CSE una serie di diluizioni e da ciascuna di queste diluizioni si preleva 1 ml e si aggiunge 1 ml di prodotto in modo da ottenere delle soluzioni le cui rispettive concentrazioni finale sono :
– 0,12 EU + prodotto (concentr. non interf.) / ml
– 0,06 EU + prodotto (concentr. non interf.) / ml
– 0,03 EU + prodotto (concentr. non interf.) / ml
– 0,015 EU + prodotto (concentr. non interf.) / ml
Si ripete l’operazione utilizzando 1 ml della soluzione di Endotossina ( CSE ) e 1 ml di acqua per LAL al posto del prodotto , al fine di ottenere il riferimentoper la prova d’interferenza .
Devono essere eseguite quattro repliche per ciascun livello di diluizione ed alla prova devono essere aggiunti due controlli negativi : acqua per LAL e la soluzione campione alla concentrazione di saggio (non interferente) allestendo rispettivamente due e quattro repliche .
Calcolo :
I valori di concentrazione di CSE corrispondenti alle ultime 4 risposte positive di entrambe le serie ( lisato + prodotto) e (lisato in acqua per LAL)che la contengono , vengono convertiti in Log e di essi vengono calcolate le due Medie geometriche .
Gli antilogaritmi di queste Medie rappresentano due valori di sensibilità , la presenza di interferenza risulta assente se il valore relativo alla prova contenente la sostanza da esaminare con l’aggiunta di CSE risulta non superiore al doppio o non inferiore alla metà del valore riferito alla soluzione di CSE in acqua .
…..seguirà standardizzazione RSE/CSE …. continua
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